【人物专访】超痕量植物激素的快速提取与高灵敏测定——中国科学院化学研究所 陈义研究员

　　陈义，博士，中科院化学所研究员，国科大教授/博导/分析教研室主任。曾师从竺安、胡日恒教授，1984年以“毛细管细胞电泳”获中科院化学所硕士学位并转博，1990年以“扁毛细管电泳”获博士学位，遂留所工作至今。曾分获德国洪堡、马普奖学金，于1992~94、1996~97年在德国马普发育生物所访问研究;2002~04年在美国加大伯克利分校高访。现兼北京化学会、北京色谱学会、中国色谱学会、中国仪器仪表学会分析仪器分会副理事长，中国化学会分析化学学科、色谱专业、有机分析化学专业、质谱分析专业委员会副主任，《分析化学》、《色谱》、《分析仪器》副主编及J.Chromatogr.A、《中国科学》等15种刊物执行或顾问编委。研究毛细管电泳和表面等离子体共振成像，初通质谱，倡活体分析研究。已发表论文240多篇、书3册又12章，有授权专利18件。

　　植物之境，生灵之家，食之所出，命之所系。养花怡情，植树留荫。国人如今对树木花草必已深有所感，是故举国行动，植树造林，以至于我国近年来绿地面积迅速扩展，一如GDP，成国际之最。国之幸甚，民之幸甚。

　　然花为谁开?树因何长?自非情致，亦非意感，实乃化学之功也。植物之生长，茎、枝、叶竞相上伸(顶端优势)，根、须、块潜地而下(趋地性)，或迎光而曲身(趋光性)，或过冬而休眠，全靠植物激素调控。

　　所谓植物激素，无非是些有机小分子。它们在植物体内由特定的组织或细胞合成，并被送往植物的其他部位，在微、痕量的水平上调控植物的生长或各种生理过程。

　　目前确认的植物激素有生长素(auxin)、赤霉素(GAs)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)和乙烯(ETH)，共五类。另有油菜素甾醇(BR)、多胺、水杨酸、茉莉酸等也被认为是植物激素。生长素其实就是吲哚乙酸(IAA)，由嫩芽、嫩叶和发育中的种子合成，被送往植物各处但更集中在植物生长旺盛的部位，能促进植物的生长也能抑制植物的生长，但依浓度高低而定。GAs是二萜类化合物，已知有130多种异构体，主要由未成熟的种子、幼芽、幼根等部位合成，普遍存在于植物体内，主要功能是促进植物的伸长及解除种子等的休眠。CTK是一类6位N上H被取代的嘌呤衍生物，合成于根尖，促进细胞的分裂和诱导发芽，故集中分布于正在进行细胞分裂的部位。ABA也叫休眠素，是一种具有倍半萜结构的不饱和有机分子，由根冠和萎蔫叶片合成，普遍分布于植物体内，能促成叶和芽进入休眠状态，或使茎块成形，故比较集中地存在于这些部位。ETH可在植物的各个部位合成，广泛分布在植物体内，但成熟果实中含量最多，主要是促进果实成熟和叶片衰老，还能打破植物种子和芽的休眠、抑制许多植物开花等。植物激素之间相会互相合作，例如生长素含量若接近或达到最适生长浓度时，即诱导乙烯的形成。这些植物激素及其人工合成的类似物即植物生长素，已被我们用来调控植物的生长和果实的生产，例如通过利用或抑制顶端优势，可以调节果实的分布，达到增加产量的目的。

　　要想合理利用植物激素去调控植物的生长与生产，就需要分析植物激素在植物体中的位置和浓度。因为植物激素的作用由浓度决定，例如生长素等低浓度能促进生长而高浓度会则抑制生长，因此，关于植物激素的分析不仅要测时空分布，更要精准定量。

　　目前的植物激素分析方法主要有光学分析法和分离分析法两大类，前者多利用荧光，可结合免疫原理以及基因技术等，但一般只能做间接测定;后者以色谱分离为主，便于多组分之定量测定。早期多用气相色谱-质谱(MS)联用方法，但需化学衍生以提高植物激素的挥发性。该法样品用量大，不能做植物激素的时空分布分析。随后，高效液相色谱-质谱法受到重视，得到发展，但也未能显著减少样品用量，难解时空分布分析之困。近年来，毛细管电泳、超高压液相色谱(UPLC)等微量、高效方法得到开发，似乎为时空分析打开了新的可能，但因检测下限一般只能达到nmol/L水平，样品需求多在50mg鲜植物附近，也未能解决时空分布的分析问题。

　　欲提高分离分析方法的时空分辨能力，必须提高其检测灵敏度，减少其样品用量。本研究因此首先攻关检测灵敏度。研究以UPLC-串级质谱联用(UPLC-MS/MS)为主要工具展开，结合多反应离子检测(MRM)来发展超痕量植物激素的精准测定方法。测定对象则从赤霉素开始，推及其他。原因在于赤霉素异构体丰富、检测困难、浓度低达pmol/L。如能解其分析问题，则其他植物激素的测定便会迎刃而解。

　　在植物激素分析中，少有关于GAs的专题研究，多为顺带测试。目前报道的分析方法通常都只能测定若干浓度高于nmol/L水平的组分，而且需要使用至少5-50mg的鲜植物来制作样品，只得平均结果，无法分辨时空分布，也难测不可复得之微量植物样品中的痕量、超痕量的GAs。另外，目前已发表的分析方法都采用了繁琐的样品制备过程，从植物采集、粉碎、浸提、萃取到衍生，过程漫长。这不仅会造成样品的浪费，还会造成目标组分的破坏或丢失，容易导致分析失败，或结果不可靠。要很好解决赤霉素的分析问题，需要突破以下技术难点：

　　1)GAs的快速提取：植物样品十分坚固，很难彻底粉碎，多留残渣，易致组分损失和丢失。

　　2)超痕量GAs的化学选择标记：化学反应的方法千千万，但能用于极微量样品中超痕量组分标记的化学反应方法却几乎一个无。

　　3)限量、复杂样品中超痕量GAs的精准定量测定：定量方法很多，但能用于GAs众多组分的高效、重现分离的方法却很少，高灵敏的定量分离分析方法更是少之又少。

　　不言而喻，本课题面临有重大的挑战，无法一蹴而就，需要耐心和坚持精神(好像不太符合时下的环境)。为此，我们从超痕量GAs的检测问题切入，再逆向研究到分离和样品制备上去。经过了将近10年的折腾，终于打通了层层关隘，来到了宽敞的果园，摘到了一些果子：首先，设计建立了能直接衍生pmol/L级赤霉素的无变构、超痕量的化学衍生标记方法，并以此为基础，发展了UPLC-MS/MS的高效分离检测方法;进一步结合同位素内标技术，建立了检测下限达到pmol/L的GAs定量测定方法;为将所建方法实用化，又建立了微量植物样品中赤霉素速冻粉碎浸提、液-液萃取的样品制备流程;最后，通过有机整合，实现了定量测定拟南芥等模型植物之一小段根须(~1mg)、单个花蕊(~20μg)乃至花丝(~10μg)、花药(<10μg)中GAs的种类和含量，初步实现了对植物激素在微小器官尺度上的分布测定。正在利用所建方法，对拟南芥、豆芽等模型植物中赤霉素的微小空间分布展开研究，发现了一些新的结果。

　　我们还有一个问题需要继续研究，这就是目前的样品处理技术还有瑕疵，即速冻粉碎浸提，再加液-液萃取，后接化学衍生，过程还很冗长，需要缩短。另外机械粉碎与操作人员的训练程度和技术水平有关，会因人而异，不是很合理的选择。为此，须构建更合理的快速样品处理新方法，思路是：废除速冻和机械研磨措施，换用更具生物特色的常温酶解技术，再以此为基础，发展免萃取之“一锅煮”的GAs提取和衍生标记技术。新方法已初步建成，正探讨降低背景之法。该法可望彻底简化制样过程，为建立原位采样分析方法奠定基础。

　　如所预料，新方法可直接推广用于其他含羧基植物激素的高灵敏测定。预计再结合其他化学处理技术，有可能发展成为通用的超痕量植物激素的精准测定方法。事实上，我们已开始尝试研究植物与昆虫之间的化学语言沟通课题，包括植物对虫害侵袭反应和对同伴警告信号中的化学技巧，有机会时或与大家共享。

　　致谢：本研究受国家自然科学基金资助(Nos.21235007，21475136)，其中植物样品部分由中国科学院植物研究所的徐文忠副研究员提供，谨此一并致谢!

　　参考文献：D. Li, et al. Mol. Plant, 2016, 9: 175.

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