【人物专访】蛋白质组样品的高效富集、酶解和色谱质谱分析新技术——复旦大学 张祥民教授

　　张祥民，复旦大学化学系和生物医学研究院双聘教授，博士生导师。1994年毕业于中国科学院大连化学物理研究所获理学博士学位。1986-1994年在中国科学院大连化学物理所国家色谱研究中心工作。1994年到复旦大学做博士后研究并留校工作。主要从事色谱、多维色谱、阵列色谱的新技术和仪器系统的研究，开展了蛋白质组高效富集新技术新方法研究，发展了系列磁性纳米材料用于各种蛋白质的富集、酶解与鉴定。主持了国家重大基础研究(S-973)项目课题：(2007CB914103)“多维、多模式、阵列式蛋白质高效分离新技术研究”、国家高技术研究计划(863)项目课题：(2012AA020202)“蛋白质组富集分离与修饰鉴定的关键技术研究与开发”和国家自然科学基金项目等。发表SCI论文230余篇，申请50余项专利。“生物色谱/质谱新技术新方法及其在生物分析中的应用”和“基于功能化纳米材料的蛋白质分离分析新方法”分别获得教育部自然科学一、二等奖。

　　蛋白质是细胞生命功能的直接执行者和生命活动过程的主要载体。蛋白质及其翻译后修饰决定着蛋白质在细胞内的表达量和功能，调控了几乎所有的生命活动，从而影响着个体的生长、发育和衰老过程。因此，蛋白质表达异常或都将导致细胞功能的异常，并与各种人类重大疾病如肝脏疾病的发生、发展密切相关，是当前生命科学和健康医学研究的热点。系统研究蛋白质组学平台，可促进蛋白质的分离、富集、酶解和鉴定技术的发展和应用，具有巨大的学术意义和应用价值。报告围绕蛋白质组样品的高效富集、酶解和色谱质谱分析新技术，介绍了近期研究发展的多种新技术和新方法。主要内容包括：

　　(1) 新型共价结合磁性材料的合成并用于膜蛋白的高效富集分离

　　报告着重介绍基于共价固定的方法有效除去高浓度的SDS新技术，以此来提高膜蛋白的鉴定效果。通过文献报道的一锅法合成PEG包裹的磁球。利用PEG末端羟基与三氟乙磺酰氯的反应，在材料表面修饰上低密度的三氟乙磺酰基。三氟乙磺酰基与蛋白游离氨基的高效反应能够确保膜蛋白的高效固定;长链PEG的亲水性以及迁移性能够提高活性基团与游离氨基的碰撞几率，以及后续酶解过程中固定蛋白与酶的碰撞几率;低密度的修饰活性基团可以达到膜蛋白上部分游离氨基固定的目的，降低酶解后肽段的损失。通过这种方法共鉴定到4265种蛋白，iBAQ强度分布大于6个数量级，通过跨膜结构、疏水性以及GO三种分类方法从鉴定到的4265种蛋白中筛选出2240种膜蛋白。在此基础上，我们进一步开发了一套一体化装置，用于膜蛋白的在线富集、纯化、酶解。

　　(2)深度覆盖技术的研究与应用--基于共价固定的膜蛋白高覆盖度鉴定方法

　　在上述研究基础上，发展了一种基于共价固定的膜蛋白高效鉴定方法。利用聚乙二醇具有很好的亲水性和迁移性，磁球表面的固定的长链聚乙二醇犹如章鱼触须般，能够与膜蛋白表面甚至内部的氨基接触，从而增加了末端活性基团与膜蛋白的反应机会，将膜蛋白牢固地键合到材料表面。因此，膜蛋白的增溶剂以及磷脂等干扰物便可通过洗涤以及磁性分离的方法被轻松除去。而且，膜蛋白在材料表面形成了一层疏松的蛋白质单分子层，有效地提高了酶解过程中膜蛋白与蛋白水解酶的碰撞几率，达到理想的酶解效果。实验表明，利用该磁性材料固定膜蛋白具有反应效率高、非特异性吸附小等优点，并成功运用到小鼠肝脏组织膜蛋白组的鉴定上。从膜蛋白质提取馏分中，共鉴定出5936中蛋白质，其中2946种为膜蛋白，1505种为整合膜蛋白。通过对比Peptideatlas数据库，发现了735种未包含其中的膜蛋白，可能为新的蛋白质。该方法新颖便捷，实用高效，重复性好，稳定性高，具有巨大的推广应用潜力。

　　(3)深度覆盖蛋白鉴定技术用于100个活细胞蛋白质组的超高灵敏度分离鉴定新技术

　　100个活细胞的超小样本直接酶解鉴定新技术：开发了“一步法酶解活细胞”的样品处理技术用于蛋白质组的分析。优化后酶解的方法，在两小时内就可以把完整细胞转化为供LC-MS系统分析的肽段，再加上两小时的肽段分析时间，在四小时的时间内就可以从细胞样品中得到完整的蛋白质组信息，具有极大的应用前景。我们把这个方法用于人直肠癌DLD-1细胞的分析，细胞数目分别为100个，250个和500个，不同细胞数目的样品做三次重复实验，结果从100个细胞样品中总共鉴定到204个蛋白，从250个细胞样品中总共鉴定到368个蛋白，从500个细胞样品中总共鉴定到692个蛋白。其中，不同细胞数目样品中鉴定到的质膜蛋白比例占到总蛋白的17%到20%，这一比例与使用SDS的方法鉴定到的结果相当，可见这种方法对于膜蛋白是无偏向性的。

　　单细胞蛋白质组能够提供细胞的个体差异和蛋白质动态变化的关键信息。相关分离鉴定技术研究意义重大，研究发展的超灵敏度的细胞直接分析新方法，可对100个细胞的蛋白质组分离鉴定出800多个蛋白质，能够鉴定到含量200zmol的蛋白质。该方法采用活细胞直接注入分析系统、经过在线裂解与酶解，酶解获得的肽段经过微捕集器富集，直接切换进入纳流液相色谱和串级质谱分离鉴定系统，得到蛋白质鉴定结果。该新技术首次对100个细胞的微量样本实现了直接分析，系统实现了在线、自动分析，避免了样本预处理和转移过程的损失，同时发展了微反应器和微捕集器，能够对包括膜蛋白在内的各种蛋白进行鉴定，并获得了超高灵敏度的分离鉴定结果。在临床医学和生命过程分析，如循环肿瘤细胞、干细胞等稀有细胞的蛋白质组分析与比较等方面具有主要应用前景。